一、實驗目的 
  熟悉植物培養基的基本成分及其作用，掌握培養基的配制、分裝方法及操作要求，掌握培養基與接種用品的滅菌原理及高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。
  通過月季等園林植物的組培操作，了解植物組織培養的基本原理和一般方法，及其在園林植物育種中的應用。
二、實驗原理 
  培養基主要為離體培養植物材料的生長提供營養物質和生長調劑物質，通常分為基本培養基和完全培養基兩個水平。前者包括大量元素（無機營養元素）、微量元素、有機附加物（維生素、氨基酸等）、糖和水，固體培養基還需加入凝固劑如瓊脂；完全培養基是在基本培養基的基礎上，根據不同的試驗材料和目的，添加一定濃度的生長調節劑如 BA 、 NAA 等以及成分復雜的有機附加物如椰子汁、水解酪蛋白等。另外，培養基還應具有適宜的 pH 值。不同種植物的離體培養，甚至同種植物不同器官或組織的培養對培養基的要求可能有些不同。園林植物離體培養常用的基本培養基主要有 MS 、 N6 、 B5 、 Nitsch 、 White 、 WPM 等。
  瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質，是應用*廣的凝固劑。加入瓊脂制成的培養基在 98 ～ 100 ℃下融化，于 45 ℃以下凝固。但多次反復融化，其凝固性會降低。
  植物培養基含有豐富而**的營養物質，能供養很多細菌、真菌等微生物的生長。因此，任何一種培養基一經制成便需及時徹底滅菌，以備培養之用；接種時使用的所有用品如濾紙、水等也要進行滅菌。一般采用高壓蒸汽滅菌，于高壓滅菌鍋內進行，在 1.1 kg/cm 2 、 121 ℃的條件下消毒 20 ～ 25min 。
  研究表明，植物的細胞具有全能性，即在一定的培養基（包括營養成分、激素等）和培養條件下可再生出完整的植株。通過合適的激素配比和培養條件可調控植物細胞的分裂和分化，改善植物的分化和繁殖能力。
三、主要儀器及試材 
1 ．儀器用具
  電子天平、稱量紙、牛角匙、精密 pH 試紙、量筒、燒杯、膠頭滴管、移液管、玻璃棒、培養皿或培養瓶、封口膜、電爐或微波爐、滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、超凈工作臺、鑷子、手術刀、無菌濾紙、酒精燈、培養箱（室）等。
2 ．藥品試劑
  大量元素（ NH 4 NO 3 、 KNO 3 、 MgSO 4 ·7H 2 O 、 KH 2 PO 4 、 CaCl 2 ·2H 2 O ）、微量元素（ KI 、 H 3 BO 3 、 MnSO 4 ·4H 2 O 、 ZnSO 4 ·7H 2 O 、 Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 、 CuSO 4 ·5H 2 O 、 CoCl 2 ·6H 2 O ）、有機成分（肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸）、 FeSO 4 ·7H 2 O 、 Na 2 EDTA·2H 2 O 、 瓊脂、蔗糖、 0.5M NaOH 、 BA 、 NAA 等。
  培養基（包括大量元素、微量元素、有機成分、植物激素等）、無菌水、脫脂棉、 95 ％酒精、雙氧水、蒸餾水等。

四、實驗方法與步驟 
  1 ． 培養基母液的配制 —— 以 MS 培養基為例 
  MS 培養基含有近 20 種營養成分，為了避免每次配制培養基都要對這些成分單獨進行稱量，可將培養基中的各類成分，分別按原用量的 20 倍或 200 倍配成濃縮液，即培養基母液。這樣每次使用時，取其總量的 1/20 （ 50 ml ）或 1/200 （ 5 ml ），便可配成培養液（基）。
  1 ）大量元素母液（ 20 ×）：分別稱取 33g NH 4 NO 3 、 38g KNO 3 、 7.4g MgSO 4 ·7H 2 O 和 3.4g KH 2 PO 4 ，裝入 500ml 燒杯中，加入適量蒸餾水將其充分溶解；另稱取 8.8g CaCl 2 ·2H 2 O ，單獨溶于 200ml 蒸餾水。然后將二者混合，定容至 1 L ，充分混勻后于 4 ℃條件下貯存備用（下同）。
  2 ）微量元素母液（ 200 ×）：分別稱取 4.46g MnSO 4 ·4H 2 O 、 1.72g ZnSO 4 ·7H 2 O 、 1.24g H 3 BO  
  3 、 166mg KI 、 50mg Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 、 5mg CuSO 4 ·5H 2 O 、 5mg CoCl 2 ·6H 2 O ，加蒸餾水溶解后，定容至 1L 。
  3 ）有機成分母液（ 200 ×）：分別稱取 10g 肌醇、 50mg 煙酸、 50mg 鹽酸吡哆醇、 50mg 鹽酸硫胺素、 200mg 甘氨酸，加水溶解后，定容至 500ml 。
  4 ）鐵鹽母液（ 200 ×）：稱取 5.56g FeSO 4 ·7H 2 O 和 7.46g Na 2 EDTA·2H 2 O ，分別溶于 450ml 蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解，然后將兩種溶液混合，于 80 ℃水浴中充分熬合（ 30min ），*后定容到 1 L ，保存于棕色容量瓶中。
  生長調節劑母液：稱取 50mg 或 100mg 植物生長調節劑（如 BA 、 NAA 、 IBA 等）粉末，置于 100ml 容量瓶，生長素類先用少量酒精溶解，細胞分裂素類先用少量 0.5M NaOH 溶解，然后以蒸餾水定容至刻度，即配成 0.5 或 1.0 mg/ml 的母液。
  2 ． 培養基的配制 
  以配制 1 L MS ＋ BA 1.0mg/L ＋ NAA 0.5mg/L 固體培養基為例，基本操作過程如下：
  1 ）稱取 30g 蔗糖和 7g 瓊脂，裝入 1 L 的容器（如燒杯）中，加入約 700ml 蒸餾水，置于帶石棉網的電爐上或微波爐中加熱，并用玻棒攪拌，至瓊脂完全溶化。
  2 ）用量筒或移液管分別取 50ml 大量元素母液、 5ml 微量元素母液、 5ml 有機成分母液和 5ml 鐵鹽母液，加入上述容器中。
  3 ）分別用 1ml 移液管吸取 1ml BA 母液（ 1.0mg/ml ）和 0.5ml NAA 母液（ 1.0mg/ml ），加入培養基中，然后加蒸餾水將總體積定到 1000ml 。
  4 ）以 0.5M NaOH 溶液將培養基的 pH 調至 5.8 ～ 6.0 ，混勻后分裝于培養容器中，每瓶裝入約 30ml 培養基，然后用聚乙烯膜封口。如果采用培養皿進行培養，配制好的培養基可先裝入三角瓶，滅菌后（培養皿同時滅菌）于超凈工作臺上進行分裝。
  3 ．滅菌 
  將培養基、無菌水、濾紙、器皿等放入高壓滅菌鍋內，于 1.01kg/cm 2 壓力、 121 ℃條件下滅菌 20min 。滅菌完畢后，將培養基取出（其他滅菌材料一并取出），水平放置于實驗臺上，待其冷卻凝固后便可用于接種培養。
  具體操作按滅菌鍋的說明書進行，包括加水、裝鍋、蓋蓋、加熱、排放冷空氣、升壓保溫、降壓排氣、出鍋冷卻等步驟。
  徹底滅菌后的培養基可于實驗室內保存一段時間，但*好盡快使用。
  4． 接種材料（外植體）的消毒： 將帶腋芽的枝條剝去枝條上的葉片，先以自來水沖洗干凈，再在超凈工作臺上以 70% 的酒精和 0.1% 升汞溶液進行表面消毒，無菌水漂洗 3 ～ 5 次。然后在無菌條件下將帶芽的枝條切成芽段（每段帶有一個腋芽），用于接種。試管苗不需經過消毒可直接將其切成芽段進行接種。
  5 ．接種： 將外植體材料接種到已滅菌的培養基中。
  6 ．培養： 將接種好的材料置于培養箱或培養室內進行培養。培養條件為溫度 25 ± 1 ℃，光照強度 1000 ～ 1200 lux ，光照時間 12 h/d 。
  7 ．繼代增殖： 將萌發后的嫩芽切下，接種于繼代培養基上，調整培養基中附加激素的比例，可獲得大量的叢生芽。
  8 ．生根培養 ：將長到一定高度的芽切下，接種到生根培養基中，誘導生根后移植。
  9 ．試管苗的移栽 ：將誘導發根后的月季試管苗從培養瓶中輕輕取出，洗凈根部培養基。植株上部只保留 3 ～ 4 片葉，其余的葉剪去，將其細心地移入準備好的小盆中。浸透水后置于塑料棚內。棚內空氣濕度保持在 85 ％以上，溫度 10 ～ 20 ℃左右。一周后慢慢揭膜練苗，半月后將薄膜全部揭開，并噴施稀薄營養液，使小苗得到營養補充。
五、實驗注意事項 
  1 ．配制培養基母液的濃度應根據實際使用情況確定，*好能使母液在 1 ～ 2 個月內用完，其中有機成分要在 4 ℃冰箱內保存。大量元素母液的配制過程中， CaCl 2 必須單獨溶解，然后再與其他成分的溶液混合，否則溶液中易出現沉淀；配制鐵鹽母液時，兩種成分應單獨溶解后再于 80 ℃左右充分熬合，避免發生結晶沉淀。
  2 ．配制培養基的所用器皿和用具均應洗滌干凈，培養基的 pH 值應調整準確，滅菌時間不宜過長，否則培養基可能會出現不凝固現象。
  3 ．培養基配制后應及時進行滅菌，如因特殊情況不能及時滅菌，*好放入冰箱內暫存。
  4 ．高壓滅菌鍋的使用應嚴格按照說明書進行操作，尤其注意檢查鍋內水位，防治干燒導致電熱管損壞。
六、實驗結果處理 
  １． 5 ～ 6 人為一組，每組按要求配制一種培養基，分裝滅菌。
  ２．記錄培養基配制與滅菌的一般程序和注意事項。
  3．所有的實驗用具均需嚴格洗凈，和培養基一起滅菌后使用。
  4．接種的整個過程都需在無菌條件下進行，不得違章操作。
七、思考題 
  １． MS 培養基的主要成分有哪些？在植物材料的離體培養中各起什么作用？
  ２．如何保證滅菌后培養基能正常凝固？
  3．植物組織培養的原理是什么？
  4．談談植物組織培養在園林植物育種中的應用價值。